Affinity Purification-MS

Recherche de partenaires par co-immunoprécipitation ou “Affinity purification coupled with mass spectrometry” (AP-MS)

La plateforme a fréquemment la charge d’analyser les protéines purifiées par affinité au cours d’expériences menées par les équipes en demande. Les purifications préalables à ces analyses : co-immunoprécipitation, GST pull-down, précipitation à partir de peptides ou d’oligo-nucléotides fixés sur un support solides etc., restent cependant à la charge de l’équipe demandant l’analyse.

La plateforme joue néanmoins un important rôle de conseil en stratégie de purification car les équipes demandant ces analyses ne sont pas toujours conscientes de la relative faiblesse de spécificité de ces protocoles de purification, particulièrement quand elle n’est basée que sur une seule étape d’affinité.

Les protéines spécifiques sont fréquemment des protéines minoritaires parmi de nombreux contaminants. Il est donc extrêmement important d’inclure des contrôles de spécificité dans les protocoles de purification (anticorps pré-immuns, matériel biologique ne contenant pas la protéine appât, etc..). Nous recommandons d’autre part d’analyser l’ensemble des protéines purifiées en vue de leur identification et pas seulement les bandes visibles à la coloration qui paraissent différentielles.

Il est fortement conseillé de contacter la plateforme dès la mise en place de la stratégie de recherche et ce pour donner le maximum de chances de succès d’identification des protéines. Vous pouvez par ailleurs consulter un document rédigé par 3P5 ainsi que les articles suivants résumant assez bien les stratégies et pièges à éviter :

Document de 3P5 : Recherche des partenaires d’une protéine par MS

Equipe Lamond : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21365760

Equipe Gingras : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23153790

Préalablement à l’entrevue et pour avoir réponse aux principales questions posées lors de l’entrée de l’échantillon sur la plateforme, vous pouvez préparer une brève description de :

vos objectifs
votre approche d’Immunopurification : billes, Protéines A/G, anticorps utilisés (primaires, secondaires, espèce, type clonal), couplage covalent bille-anticorps (permet d’éviter à nos appareils d’être saturés par le signal provenant d’IgG + protéines A/G). voir protocole fixation DMP :

Protocole fixation des IgG sur billes

Néanmoins, certains anticorps peuvent être inactivés lors du couplage.

des contrôles de fractionnement et d’enrichissement de votre protéine appât (voir le document exemple). Il convient en effet de vérifier la présence de la protéine cible et sa répartition de fractionnement en fonction des conditions employées :

1- dans le lysat brut (ou homogénat),

2- dans le surnageant de centrifugation du lysat qui servira d’input,

3- dans le culot de cette centrifugation (resuspendu dans un volume de tampon Laemmli équivalent à celui du lysat de départ),

4- dans le surnageant après IP pour en contrôler la bonne déplétion,

5- dans une proportion équivalente de l’eluat d’IP pour en mesurer l’enrichissement.

Ensuite, une gamme de conditions d’IP (volume de billes-anticorps/volume de lysat) permettra de déterminer le ratio optimal permettant de maximiser la récupération de l’appât en minimisant la quantité de protéines aspécifiques généralement entraînées par les billes, les protéines A/G ou les anticorps. Ces protéines sont généralement invisibles au Western-Blot mais en cas d’excès important de billes, elles peuvent être si abondantes et nombreuses qu’elles en oblitèrent la détection de la protéine appât.

des contrôles effectués pour vous assurer de la spécificité de la purification (IP sur lysat de cellules n’exprimant pas l’appât, idéalement la version KO ou non transfectée par exemple).
ce qui est essentiel pour élaborer notre angle d’attaque de l’analyse à venir : obtenir une estimation de la complexité et de l’abondance de vos échantillons, généralement par un gel SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie (colloïdal idéalement) comparable en séparation au WB qui vous a permis de suivre votre IP si il y a eu lieu.

Les échantillons à analyser en vue de l’identification de protéines purifiées peuvent être transmis sous forme de solutions. Un formulaire spécifique de description des échantillons en solution est disponible. Il devra être transmis à 3P5 sous forme électronique et un exemplaire imprimé devra accompagner les échantillons. Aucun échantillon ne sera traité en absence de ce formulaire. Ce formulaire contient aussi des recommandations sur la préparation des échantillons, il est généralement renseigné par nos soins suite à une première réunion puis doit être validé avant d’accompagner vos échantillons sur la plateforme.

Ultérieurement, vos résultats vous seront transmis et inévitablement un certain nombre de protéines non spécifiques “pollueront” la liste de protéines malgré les soins apportés à la préparation. Les contrôles effectués pourront vous aider à soustraire un certain nombre de ces polluants, ainsi que les données du “CRAPome” ; une banque de données de protéines régulièrement retrouvées dans ce type d’analyse en fonction des stratégies employées.

Un traitement statistique de base ne peut être valable qu’à partir de répliquas biologiques suffisants (n=4). Néanmoins, les répliquas attendent généralement qu’un tir d’essai donne des résultats encourageants. Prévoyez-les dans vos objectifs cependant.

Une aide précieuse au tri des nombreuses protéines identifiées est apportée par les outils bioinformatiques (soustraction du “CRAPome”, classement ontologique, interactome théorique utilisant les informations des publications (humain, souris) avec Ingenuity Pathway Analysis®. N.B. : Cette aide est optionnelle et conditionnée au résultat de l’analyse, elle n’est pas incluse dans la prestation initiale.