Analyse des sécrétômes

Les contraintes d’une analyse de sécrétôme

La plupart de ces protéines étant produites en très petites quantités, leur analyse nécessite de prendre un certain nombre de précautions. En particulier, il est indispensable de limiter au maximum la contamination de ces protéines sécrétées ou relâchées dans le milieu extracellulaire par des protéines de différentes provenances.

Les cultures cellulaires sont réalisées le plus souvent avec des ajouts de protéines exogènes : sérum (souvent de veau fœtal, quelquefois de cheval ou d’autres espèces animales) ou additifs de milieux dits « définis » contenant toujours différentes protéines plus ou moins pures : BSA, transferrine, facteurs de croissance….

Ces protéines sont généralement incompatibles avec l’analyse du sécrétôme puisqu’elles sont beaucoup plus abondantes que les protéines relâchées dans le milieu extracellulaire par les cellules.

La première étape à franchir est donc de mettre en place des conditions permettant aux cellules, sinon de proliférer, tout au moins de survivre et de sécréter des protéines en absence de la majorité de ces protéines. L’ajout en faible quantité de certaines de ces protéines comme des facteurs de croissance peut être toléré. Il est dans ce cas indispensable de vérifier que ces facteurs de croissance ne sont pas conditionnés avec des quantités importantes de protéines stabilisatrices.

Méthode

En général, les cellules sont amplifiées selon les conditions classiques de culture c’est à dire en présence de sérum de veau et/ou autres additifs, puis les cellules sont placées dans un milieu sans protéines exogènes pour recueillir les protéines relarguées dans le milieu extracellulaire. Cette procédure est évidement susceptible de modifier le métabolisme cellulaire et la sécrétion de protéines mais il est impossible de faire autrement.

Cette adaptation des conditions de culture est nécessaire mais elle ne met généralement pas à l’abri de contaminations de deux types : par des restes de protéines du milieu de culture qui s’accrochent aux cellules ou au plastique des flacons de culture et par des débris cellulaires ou des cellules lysées au cours de la phase de production ou de récupération du sécrétôme.

Pour éliminer le premier type de contamination, il ne suffit généralement pas de laver les cellules avant de les placer dans le milieu sans protéines. Une bonne précaution est de bien laver les cellules avec le milieu sans protéines, de les incuber 1 à 2 heures dans ce milieu puis de laver à nouveau les cellules avant de poursuivre l’incubation sur 12 à 24 heures pour récupérer les protéines sécrétées. La figure ci-dessous illustre l’importance de cette étape de nettoyage des cellules pour limiter les contaminations par des protéines du milieu de culture.

La lyse d’une fraction des cellules est inévitable. Pour limiter la contamination par ces protéines cellulaires, une précaution indispensable consiste à centrifuger à 2.000 tpm (environ 800 g) le surnageant juste après récupération puis de le filtrer (filtre 0.45µm) avant de le congeler à-80°C jusqu’à son traitement.

Lorsque la culture cellulaire n’est pas vraiment une étape limitante, plusieurs centaines de ml de surnageant de culture peuvent ainsi être collectés et conservés à -80°C.

Après décongélation, les surnageants sont concentrés par ultrafiltration sur des membranes avec des seuils de coupure de 10kDa puis le milieu de culture est échangé contre un tampon et un détergent compatibles avec la digestion trypsique. Les peptides générés sont ensuite analysés par spectrométrie de masse en tandem.

Ces analyses peuvent être couplées avec des méthodes de marquage isotopique pour réaliser des comparaisons quantitatives des sécrétômes de plusieurs types cellulaires. La plateforme dispose de plusieurs techniques permettant de marquer métaboliquement les protéines lors de leur synthèse (marquage SILAC) ou les peptides après digestion (marquages iTRAQ ou TMT).