Phosphoprotéomique

L’analyse du phosphoprotéome est délicate et présente plusieurs difficultés :

• bien que de très nombreux résidus phosphorylables, S, T ou Y sont phosphorylés dans différentes conditions physiologiques, la proportion de la forme phosphorylée de chaque peptide par rapport à sa forme non phosphorylée est généralement faible et l’analyse des phosphopeptides par spectrométrie de masse est globalement défavorable.
• les formes phosphorylées, outre qu’elles sont en général minoritaires, s’ionisent aussi généralement moins bien que les formes non phosphorylées. D’autre part, dans le cas des phosphorylations sur sérine ou thréonine, la liaison du phosphate est assez fragile et casse généralement très facilement lors de l’analyse MS/MS utilisant la fragmentation par collision.
• s’il est généralement aisé d’affirmer qu’un peptide identifié porte effectivement un phosphate, le positionnement du phosphate lorsque le peptide contient plusieurs résidus phosphorylables est souvent plus aléatoire.
• enfin, l’identification de peptides phosphorylés ne présente généralement en soi que peu d’intérêt et ces méthodes d’analyse doivent être couplées à des techniques de comparaison pour évaluer les variations quantitatives de phosphorylation selon les conditions physiologiques. La plateforme a mis en place des solutions pour répondre à l’ensemble de ces questions.

L’analyse quantitative relative permettant de comparer le phosphoprotéome de plusieurs échantillons requiert un marquage isotopique des peptides. Ce marquage peut être réalisé de façon métabolique par l’incubation de cellules en culture avec des acides aminés marqués isotopiquement (méthode « SILAC ») ou de façon chimique après digestion des protéines lorsque le matériel biologique ne peut pas être marqué métaboliquement. Chaque fois que le marquage métabolique est possible, il devra être préféré au marquage chimique puisqu’il permet de mélanger très rapidement les échantillons à analyser ce qui limite les variations expérimentales. Dans les deux cas, il convient de considérer que l’analyse nécessite une quantité importante de matériel de départ pour réaliser une étude permettant d’identifier des phosphopeptides relativement minoritaires : plusieurs milligrammes de protéines de chaque échantillon (idéalement 10 mg par échantillon) sont en effet nécessaires pour espérer identifier plusieurs milliers de peptides phosphorylés dans des cellules eucaryotes. La technique utilisée par la plateforme associe un fractionnement de l’extrait peptidique total par chromatographie d’échanges d’ions et des séparations des phophopeptides par affinité pour différents oxydes métalliques.

Les phosphorylations sur les résidus tyrosine sont beaucoup moins fréquentes que les phosphorylations sur des résidus sérine ou thréonine (la fréquence moyenne chez les mammifères est S : 80%, T : 19%, Y : 1%). Les phosphorylations sur tyrosine sont généralement des événements précoces lors de l’activation de certains types de récepteurs ; récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) et récepteurs de cytokines en particulier. Ces phosphorylations sur tyrosine sont ensuite relayées par des phosphorylations sur des résidus S ou T. Une analyse globale du phosphoprotéome ne permet généralement d’identifier qu’une proportion très faible des peptides phosphorylés sur Y. Si l’activation de tyrosine kinase(s) est supposée, il est fortement souhaitable de compléter une analyse globale du phosphoprotéome par une analyse spécifique des peptides phosphorylés sur résidus tyrosine.

La plateforme a mis en place des méthodes pour répondre à l’ensemble de ces problèmes : méthodes de marquage métaboliques ou chimiques, d’enrichissement en phosphopeptides globaux ou spécifiquement phosphorylés sur tyrosine, analyse par spectrométrie de masse.

Des anticorps susceptibles d’immunoprécipiter des peptides phosphorylés sur des sites typiques de certaines kinases sont disponibles commercialement. Il existe par exemples des anticorps reconnaissant la séquence R/KXXR/KpS/pT qui est fréquemment phosphorylée par différentes kinases dont Akt. Ces anticorps peuvent être utilisés pour identifier les substrats de certaines kinases (voir Moritz et al., 2010 : Akt-RSK-S6 kinase signaling networks activated by oncogenic receptor tyrosine kinases. Sci Signal 3, ra64.). N’hésitez pas à nous contacter pour ces analyses.

Les méthodes décrites ci-dessus sont destinées à identifier un nombre maximum de peptides phosphorylés dans des mélanges complexes, typiquement des lysats cellulaires ou tissulaires totaux. Une autre question fréquemment posée est la recherche de résidus phosphorylés sur une protéine particulière. Contrairement à ce que pourrait laisser supposer la simplicité apparente de la question posée, sa résolution est souvent beaucoup plus difficile que l’identification globale (qui n’est jamais exhaustive) d’un phosphoprotéome. La plateforme réalise ce type d’analyse mais il faut savoir :

• que la quantité de protéine raisonnablement purifiée nécessaire à ce type d’analyse est souvent élevée,
• que plusieurs analyses utilisant des paramètres différents (protéases de spécificités différentes, utilisation de différents systèmes d’enrichissement de phosphopeptides) sont généralement nécessaires,
• que le résultat n’est jamais garanti. La plateforme étudie toute demande de ce type d’analyses.

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